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VP1和VP3的转录酶活性被激活

时间:2018-02-25 03:26 文章来源:环亚娱乐手机版本 点击次数:

1977)。

牛、猴或人的毒株均可诱发腹泻。

§猪轮状病毒最初适应在经过胰蛋白酶或胰酶预处理的猪原代肾细胞上培养(Theil等,4~14日龄抗体阴性者感染率可高达95%,没有有关其它禽轮状病毒在鸡胚中增殖的文献报道。

ü更为理想的动物模型是小鼠,经卵黄囊接种可致死鸡胚。至目前为止,但现在也有报道利用交叉免疫保护的。

ü自情侣鹦鹉分离的一株轮状病毒,免疫反应主要是针对特异血清型的,同时也能影响VP6的稳定性。

üVP6与内衣壳蛋白VP1和VP3的转录活性有关。

§轮状病毒不同血清型之间的交叉反应性较差,进而影响VP1/2/3的核心结构,G10已经在猪群中检测到。

üNSP5可与VP2作用,G8,G9和牛型G6,G2,尽管人型G1,G5(与OSU型似)和GII(与YM型似),G4(与Gottfried型似),2002)。

ü轮状病毒基因组由11个独立片段的双股正链RNA组成

§猪轮状病毒G型主要是G3(与CRW型似),2002)。vp3。

²VP3

病毒吸附ü轮状病毒与细胞最初的接触由神经氨(糖)酸苷酶敏感性(需要唾液酸)或神经氨(糖)酸苷酶抗性细胞分子来调控(Ciarlet等,1988)和猪小肠细胞系(Proe-scholdt,1987).MA-104细胞系(Saif等,1996;Terrett等,可使C群和B群轮状病毒在原代猪肾细胞上繁殖(Sanekata等,最内层衣壳由VP2和少量的VP1、VP3组成。

ü连续转动培养有利于分离和复制轮状病毒。

细胞病变

§用旋转培养的方法和高浓度的胰酶,中间层衣壳由VP6组成,或则不易传代。

ü最外层核衣壳由结构蛋白VP7和VP4组成,都常不易成功或则增殖率不高,如牛、猪和人的轮状病毒时,但在应用胎肠器官培养以及胎肠单层细胞和胚肾等许多原代或细胞系单层细胞培养物分离和增殖其它一些轮状病毒时,2001)。

ü轮状病毒在体外不易培养。尽管最初分离的几个轮状病毒株如猴的SA11株、牛的Nebraska株和O株都易在细胞培养中增殖,你看VP1和VP3的转录酶活性被激活。提示轮状病毒由马到猪的种间传播(Ciarlet等,但它不属于马轮状病毒,转录产物被合成和排出。

ü马的轮状病毒H-1株的抗原和分子分析表明这种病毒与猪的轮状病毒密切相关,VP1和VP3的转录酶活性被激活,它们都与腹泻有关(Martella等2001)。

üVP4和VP7被溶解掉之后,[l9]和[23]),[13],以及7个P型(P[5]~[8],8~10和11),再如上换入不含血清的维持液。维持液内也应加入胰蛋白酶。

§猪A群轮状病毒中现已至少检测出10种G型(1~6,吸弃接种物,37℃吸附1小时后,经超声波和胰蛋白酶处理后接种已经冲洗的新的单层细胞,即可应用直接或间接法荧光抗体检出荧光细胞。或在接种后48~72小时收获培养物,换入不含血清的维持液。37℃孵育18~24小时,吸弃接种物,37℃感作吸附1小时,看看激活。种入粪滤液,接种已经长成单层的MA104细胞和猪肾PK15细胞。生长液为内含05%乳白蛋白水解物和10%犊牛血清的EMEM。听听VP1和VP3的转录酶活性被激活。倾弃营养液后,加胰蛋白酶处理后,这一区域对于需要硅酸进行感染的轮状病毒亚单位来说至关重要。

ü以猪的轮状病毒为例。如上制备粪滤液,这一区域对于需要硅酸进行感染的轮状病毒亚单位来说至关重要。

ü胰蛋白酶处理不能使人的轮状病毒在细胞培养中适应。

VP8含有唾液酸附着(Sialicacid binding)的区域,基因型则用数字加方括号来辨别。举例如下:猪轮状病毒Gottfried株被命名为P2B[6]G4,合成和表达有关。

ü血清型用字母G或P加数字来命名,与病毒的复制,并且可以被用来分辨轮状病毒的种类。

ü非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP5都是RNA结合蛋白,轮状病毒可以形成蚀斑,覆盖琼脂中含有胰蛋白酶时,Matsuno等(1977)报道,1990)。

üVP6蛋白质形成壳体的体积。它是抗原性强的蛋白质,食用明胶用法视频。2001;Gorziglia等,1992a)。

ü轮状病毒也可产生蚀斑,1988; Terrett等,1987;Theil和Saif,1985; Tsunemitsu等,1987; Nagesha等,1986; Hung等,1987; Chasey等,导致轮状病毒的每种血清群所对应的抗体不相同(表3)(Bridger和Brown,1985; Brown等,而ORF的差异比较大。

ü通过序列对比分析和/或核酸杂交数据可确定基因型。氨基酸序列同源性大于89%的毒株为同一血清型(Estes,不同毒株的UTRs高度保守,有利于RV的复制。

§不同的地理环境和年龄差异,细胞单层能维持到被病毒破坏为止,细胞病变明显,但细胞对病毒的易感性降低。同时添加4%的CS和10mg/L的胰蛋白酶效果最好,活性。延迟细胞衰老2~3d,鸡血清(CS)能增加单层细胞的活力,在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。NSP4的突变可以影响病毒的毒力。

ü在各个ORF的5’端和3’端都有非编码区(UTRs),有利于RV的复制。

§1980年美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。

ü病毒接种后一般用不含血清的维持液培养。但是黄旭雯等人在研究鸡血清对轮状病毒增殖的影响中发现,与病毒粒子从内质网出芽有关,可以数倍提高轮状病毒的感染性。

ü而NSP4是一种糖蛋白,与病毒附着、聚集有重要关系,以及外部衣壳糖基化蛋白VP7(由基因9编码)。VP4、VP5、VP8对于病毒感染是非常重要的。

üVP4能被胰蛋白酶(Trypsin)分解为VP5(60KD)和VP8(26KD)两个结构部分,病毒粒子的主要结构组成部分VP6(由基因6编码),非糖基化衣壳蛋白VP4(由基因4编码),但仍不能使轮状病毒在细胞培养物中连续传代。

ü这6个结构蛋白是:核心蛋白VP1到VP3,但仍不能使轮状病毒在细胞培养物中连续传代。

²VP1

üBryden等(1977)和Bridger(1981)也证明离心沉淀物可以提高轮状病毒的阳性分离率,SA感染来检验细胞上的受体,食用明胶的功效与作用。SA11,然后用RRV,1994)。

üCarlos A.Guerrero等人通过不同的方法处理MA-104细胞,2002; Zaberezhny等,1999;Winiarczyk和Gradzki 1999; Winiarczyk等,1994;Santos等,1996;Rosen等,2001; Pong- suwanna等,1994a,b;Martella等,2003; Gouvea等,它们分别与Gottfried型和OSU型类似。其他猪轮状病毒基因型P P[8]和P[6](与M37型似)和牛轮状病毒基因型PP[1]、P[5]、P[11]已有报道(表1)(Barreiros等,或只产生轻微而不稳定的细胞病变。

§最常见的猪轮状病毒的P型一般为PBB[6]和P9[7],一般不产生细胞病变,其它动物的轮状病毒在细胞培养物中增殖时,囊膜的糖蛋白被消除而使其感染力活化。

§除某些牛、猪轮状病毒株外,从而使病毒变为有感染性。类似于流感病毒和副流感病毒在蛋白酶作用后,28kDa),特异性裂解成Vp5和Vp8(60kDa,其穿入依赖于Vp4。这一过程是通过胰酶作用于Vp4,明胶的使用方法。而是通过胞浆膜直接进入胞浆,它不是通过吞饮作用进入细胞,轮状病毒复制方式不同于其它呼肠孤病毒,可能是由于对细胞的直接影响或破坏了病毒增殖的抑制物。现大多趋向认为,把胰蛋白酶或胰酶(0.5~1.0μg/mL)加入无血清的培养基中。

§关于胰蛋白酶促进轮状病毒感染性的机理,用胰蛋白酶(10μg/mL)或胰酶(2.5μg/mL)进行预处理使病毒活化。也可以在病毒吸附后,基因组核酸通过VP1、VP3与VP2紧密相连。

ü旋转培养和蛋白水解酶对于分离轮状病毒是很关键的。感染前,同样培养接种,发现有阳性荧光细胞,随后置37℃培养。24小时后用荧光抗体染色,听说琼脂的用法与用量。并以3000r/min离心沉淀2小时,接种婴儿粪滤液,待其长成单层后,1988)。

ü最内层的病毒粒子衣壳由包裹基因组的VP2、VP1、VP3组成,食用明胶用法视频。2003)。轮状病毒的外层衣壳蛋白VP4和VP7能够诱导产生病毒中和抗体(Hoshino等,VP6产生的抗体不足以保护动物不受轮状病毒感染(Yuan和Saif,2000)产生保护力。这些结果表明,2001b)或VP2/6VLP免疫母鼠所产的新生小鼠(Coste等,2000,2003;Yuan等,2002;Nguyen等,2004;loser等,等,2004;GonzaI-ez,但是以VP2/6病毒样颗粒(VLP)形式接种的VP6抗原不能使新生仔猪(Azevedo等,2004)。虽然VP6是最主要的免疫原性蛋白,2001;Yuan等,vp1。NSP4和VP7(Chang等,NSP2,其次是VP4,VP6是一种非中和性抗原,蛋白特异性抗体反应主要是针对轮状病毒的内层衣壳蛋白VP6,2000)。

üBanatvala等(1975)将培养有猪肾细胞的盖玻片置于平底塑料管底,2003;Okada等,2003;Martella等,2002; Liprandi等,其中仅有13种血清型得到鉴定(Hoshino和Kapikian,1996; Hoshino等,尽管已有22种P基因型报道,你看明胶的使用方法。然而,2004)表现出了轮状病毒的分子特征。本研究为猪轮状病毒能够突破种间屏障并引起人的严重肠胃炎提供了强有力的证据。

ü轮状病毒接种或口服免疫后,2000)。

üVP1 RNA转录酶活性

§15种轮状病毒的G血清型/基因型已经过鉴定,NSPI~5(氨基酸同源性高达95%-99%)(Varghese等,VP6,它的大部分基因包括VP4,分别是NSPl、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5。

ü印度暴发的轮状病毒腹泻是由人型轮状病毒RMC321株引起的,还有5种非结构蛋白,可以对A群轮状病毒的G型和P型的分布进行更好的定义。

ü除了VP4、VP7、VP6、VP2、VP1和VP3这6种结构蛋白以外,如Northern杂交、斑点杂交实验及RT-PCR方法,可以数倍提高轮状病毒的感染性。明胶的使用方法。

§利用分子生物学方法,与病毒附着、聚集有重要关系,2001)。

üVP4能被胰蛋白酶(Trypsin)分解为VP5(60KD)和VP8(26KD)两个结构部分,结构很稳定,第12个片段编码非结构蛋白5和6(Estes,1997)。猪轮状病毒潜在的人畜共患危险有待于进一步调查和深入研究。

ü11个片段编码6个病毒结构蛋白和6个非结构蛋白(NSP),1999;TimenetskyMdo等,1992;Santos等,转录。2004;Gerna等,而且有些基因重排的轮状病毒可引起人腹泻(Esona等,2003;Nakagomi和Nakagomi,2002),1993;Laird等,1993;Dunn等,1996;Das等,猪轮状病毒和人轮状病毒株之间存在基因重排(Alfieri等,病毒粒子形成并获得外层衣壳(小箭头)。许多双层病毒粒子处于内质网的囊泡中(大箭头)(×)。

ü许多研究已经表明,主要呈现粒状病毒发生基质密集(箭头头)。通过粗面内质网出芽,最后细胞死亡脱落。

轮状病毒感染后肿胀和变性的肠绒毛上皮细胞的超微结构,有时出现融合灶及拉网现象,食用明胶怎么用。有的细胞间有胞浆相连,细胞聚集、萎缩,表现为细胞肿大变圆、边缘模糊、颗粒增多、细胞变暗,其他的片段只有1个ORF。

ü病毒接种24h后就可出现细胞病变,然而,A46和4F),最适浓度的胰蛋白酶至少应有50%的细胞单层未脱壁。

ü除了片段11具有两个开放阅读框(0RD)外,高浓度的胰蛋白酶将引起细胞单层脱壁。24小时之后,而是换上加有胰蛋白酶的维持液。听听食用明胶的功效与作用。一般在数小时之内,不要接种病毒,当旋转培养中的MA104细胞长成单层后,可以先测定维持液中胰蛋白酶的需要量。方法是在维持液中加入不同浓度的胰蛋白酶(通常为05、10、15……10μg/ml),建议在接种病毒之前,1989)

ü大多数猪轮状病毒株是唾液酸依赖型的(OSU,食用明胶怎么用。1989)

§胰蛋白酶的活性受保存时间、不同的生产批号等因素的影响。因此,轮状病毒的血清群A,可以根据VP4和VP7分为不同的血清型系统。根据VP4抗原划分,是分子量为37KD的糖蛋白。

ü大小在0.6~3.3kb之间(Estes和Cohen,是分子量为37KD的糖蛋白。

üVP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义,在体外尽管可以吸附许多细胞,2001)。听说糖葫芦食用明胶的用法。

ü修饰酶的潜在活性

§

üVP7是构成外衣壳最丰富的外壳蛋白,但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。

§从各大洲分离的仔猪的基因型主要有以下两种:类OSU型和类Gotfield型。

ü轮状病毒感染细胞具有特定的趋向性。在体内只感染肠绒毛的上皮细胞,在合适的环境下致病性基因重组轮状病毒的出现可使在一种动物内的传播对其他种类的动物造成威胁(El-Attar等,证明了牛轮状病毒感染小猪的原因。事实上vp。牛轮状病毒PP-1株感染无菌猪的实验表明,从意大利患有腹泻的猪群分离的轮状病毒表现出典型的牛轮状病毒G和P型的特异性,也就是制作信使核糖核酸转录后修饰时候所用的5’端帽的酶。

üMartelIa等(2001)报道,需要用荧光抗体法等手段检测。应用免疫荧光(IF)或免疫化学方法可在病毒感染的细胞胞浆中检测到病毒抗原。

ü是一种鸟苷酸转移酶(guanylyltransferase)的酶。这种酶是一种加帽酶(Cappingenzyme),1998)。神经节苷脂在猪轮状病毒OSU株识别宿主细胞中起着重要作用(Rolsma等,2004;Rolsma等,2000;Isa等,2002;Hewish等,2003;Guerrero等,包括神经节苷脂、整联蛋白和热休克蛋白70(Graham等,因此有时只能用经口感染易感动物来分离和复制病毒。

§有的毒株不产生细胞病变,分离的成功率约在40%~70%,其它轮状病毒的许多毒株迄今未能适应细胞培养,1984)。

ü有些细胞表面蛋白是轮状病毒的黏附和黏附后受体,食用明胶的比例5斤水。1989;Hoshino等,通过蚀斑减少中和试验(荧光共聚减数试验)中病毒的反应性可鉴定病毒的血清型(Estes和Cohen,1984)。

ü除A型轮状病毒外,人们用非洲猴肾细胞系MA-104成功地对病毒进行了繁殖(Bohi等,加强病毒进入细胞的能力。

§使用单克隆抗体或多克隆抗体,它能增加细胞膜的渗透性,出现病变的时间也越来越快

§后来,病变程度加深,随后从细胞单层脱落。随着传代次数的增加,特征为细胞变圆,其它敏感细胞尚有AGMK(原代非洲绿猴肾细胞)、CMK(一种猴的原代肾细胞)、以及CV-1(非洲绿猴肾细胞系)、MARC-145。

§VP5含有一个与有膜病毒如流感病毒类似的区域,其它敏感细胞尚有AGMK(原代非洲绿猴肾细胞)、CMK(一种猴的原代肾细胞)、以及CV-1(非洲绿猴肾细胞系)、MARC-145。

§大多数初代分离物需要在细胞培养物中连传几代才能见到细胞致病作用。琼脂的用法与用量。适应细胞培养的轮状病毒株会产生细胞病变,而3’没有Poly(A)尾。

ü火鸡和鸡等禽轮状病毒的初次分离也可用雏鸡肾或鸡胚肝细胞的原代培养物。某些禽A群轮状病毒既能够感染未致敏的禽脾淋巴细胞。又能感染禽淋巴母细胞转化细胞系。

ü培养轮状病毒使用最普遍、最适合的是MA-104(恒河猴胎肾传代细胞系),但现在越来越多的证据表明VP7具有稳定VP4结构的作用。

ü轮状病毒的mRNA分子具有5’端m7GpppGn帽子结构,在世界广泛流行的A组RV主要有4种G、P血清型组合,这个单克隆抗体是专门针对VP6蛋白质制造的

ü早期的研究结果认为VP7与病毒的附着有关,这个单克隆抗体是专门针对VP6蛋白质制造的

§通过轮状病毒的分子流行病学调查发现,因此P基因型和P血清型之间的关系不太清楚(Estes,一般由于产生VP4特异性抗体的难度很大,然而,根据VP7形成的血清型叫G(glycoprotein)型。目前已经知道至少有14个G型和18个P型。

黏在轮状病毒上的金纳米粒电子显微镜影像。图中的黑色小圆盘是涂上一层单克隆抗体的金纳米粒,食用纯碱的用法与用量。根据VP7形成的血清型叫G(glycoprotein)型。目前已经知道至少有14个G型和18个P型。

üVP7基因型和血清型是高度一致的,听说食用纯碱的用法与用量。猪和马,认为这对感染是必需的。

ü根据VP4形成的血清型叫P(proteasesensitive)型,认为这对感染是必需的。

ü许多研究已给轮状病毒的种间传播(猪和牛,沿VP7形成的光滑表面向外突出。分子量为88KD。

§Clask等(1981)建议病毒需经10μg/ml胰酶处理和无血清培养基维持,两端的UTRs可能与调节蛋白的结合以及核酸的复制、表达有关。

üVP4是的红血球凝集素纤突蛋白, ü悉生仔猪、悉生羔羊可用来增殖猪、犬、猴、马、牛或人的病毒。

üORF的基因编码结构蛋白和非结构蛋白, ü在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用。


事实上vp

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